血液中的游离DNA中包含了来自周身各种组织细胞的基因组，理论上也会包含各类病毒和微生物的基因组。有人之前已经注意到，游离DNA的高通量测序数据中，会有1%左右的序列不能匹配到人类基因组。

斯坦福大学Stephen R. Quake团队分析了1351例样本的cf-DNA测序数据，提取其中的非人源序列，组装后发现其中只有很少一部分能匹配上已知的细菌基因组，大多数未 鉴定序列可能来自未知微生物。该研究发表在2017年PNAS期刊。

研究样本：

1351份cfDNA的测序数据。

研究结果：

1. 提取非人源DNA并进行组装和注释

通过与GRCh38比对，大约有0.45%的序列不能匹配到人基因组（下图A），提取非匹配序列进一步与微生物基因组（细菌、真菌、病毒和真核病原体）比对，约1%的能够匹配上（下图B）。

接下来，针对那些两次都不能匹配上序列，接下来进行了de novo组装（下图E）。得到3761个contigs，其中773 个已知（>80% BLAST coverage and >1 kbp），598个divergent（>1 kbp and neither known nor novel），其余均为新的contig（novel）。并且novel contigs长的远远大于已知的contig（下图C）

2. 证明Novel Contigs并非污染或人工拼接产物

由于游离DNA片段非常短，因此很难通过PCR的方法去证明contig真实存在。所以作者选择了一下三种方法间接证明：

1) 下载数据库中使用不同建库方法、在不同实验室操作的测序数据，与组装得到的contigs进行比对，证明这些novel contigs并不是来自建库污染。

2) 生物信息学方法评估组装质量

在组装过程中，只有很少一部分contigs是orphan contigs。且这些contig在后续质控中大多数已经被删掉。剩余的contigs有很充足的证据证明是可靠的。

3） 使用对照基因组测试pipeline

人为混合 8,068个细菌基因组序列，比对之后大多数的细菌基因组没有被删除，证明数据比对的pipeline比较准确地识别细菌基因组与人基因组。

4） 使用PCR验证短序列的存在

设计若干组novel contigs的短片段引物，扩增结果证明血浆中确实存在这些短片段。

3. 对novel contigs 进行分类学鉴定

为了对3,761个novel contigs进行分类学鉴定，首先进行了核糖体序列的鉴定，发现这些序列没有16S核糖体单元的序列。之后根据基因相似性进行分类，得到了所有contig最相近的分类地位（下图）。其中有一部分（黄色）contig无法分到任何的分类单元。

4. 人类微生态中含有大量未鉴定的新噬菌体和病毒

在上述能够找到分类地位的2,917个contig中，主要包含了噬菌体和torque teno viruses (TTVs)。其中一类是非感染人类的anelloviruses（下图绿色），另一类未鉴定的黄色的基因组只有35–48%与anelloviruses相似（下图）。

总结：该文主要通过cfDNA中的序列证明了人体中可能存在大量未被鉴定和微生物，这些微生物可能在我们平常的研究和数据分析时会被忽略。通过从cfDNA中提取这些未知微生物的基因组，希望能帮助鉴定更多的人体微生物。

参考文献：

Kowarsky, Mark, et al. "Numerous uncharacterized and highly divergent microbes which colonize humans are revealed by circulating cell-free DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences 114.36 (2017): 9623-9628.

转自生信草堂公众号，已授权

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